Parazytologiczny zespół badawczy
prof. dr hab. Elżbieta Żbikowska; dr Anna Cichy; mgr Anna Stanicka
Środowiskowe uwarunkowania inwazji przywr digenicznych u mięczaków
Ekofizjologia interakcji przywry – mięczaki
Przywry digeniczne i mięczaki
Przywry digeniczne są największą w obrębie płazińców (Platyhelminthes) grupą liczącą według różnych szacunków od 18 do 25 tys. gatunków. W większości są to organizmy hermafrodytyczne, z wyjątkiem przedstawicieli niektórych rodzin jak Schistosomatidae i Didymozoidae. Znamienną cechą tych zwierząt są złożone cykle rozwojowe, których poszczególne etapy zachodzą w żywicielach pośrednich i ostatecznych. Żywicielami ostatecznymi przywr są wszystkie grupy kręgowców: ryby, płazy, gady, ptaki i ssaki, a przypadki zarażenia człowieka tymi pasożytami notowano w różnych rejonach geograficznych. Rolę pierwszych żywicieli pośrednich pełnią prawie zawsze mięczaki (zwłaszcza wodne ślimaki), w których sporocysty i/lub redie oraz cerkarie rozmnażają się bezpłciowo. Uwolnione ze ślimaka cerkarie dzięki odpowiednim przystosowaniom odnajdują w wodzie drugiego żywiciela pośredniego (różne grupy bezkręgowców i kręgowców), u którego przekształcają się w stadia inwazyjne – metacerkarie. Żywiciel ostateczny zaraża się przywrami drogą pokarmową spożywając metacerkarie z drugim żywicielem pośrednim.
Mięczaki, odgrywające kluczową rolę w cyklu życiowym Digenea, stanowią dogodny materiał do badań parazytologicznych ze względu na łatwość pozyskania w terenie i utrzymania hodowli w laboratorium. Ścisły związek mięczaków z przywrami, wyrażający się specyficznością układu pasożyt-żywiciel, pozwala na rozpatrywanie zjawiska pasożytnictwa w aspekcie:
- immunoloigicznym (reakcje mięczaków na wniknięcie przywr, mechanizmy obronne przywr)
- fizjologicznym (wpływ przywr na behawior, płodność i wygląd mięczaków)
- ekologicznym (regulacja liczebności populacji mięczaków przez przywry, modulowanie interakcji zarażonych mięczaków z innymi organizmami, przywry jako wskaźniki “zdrowia ekosystemu”, klasyczne i zmodyfikowane cykle życiowe przywr)
- ewolucyjnym (specyficzność układu przywra – mięczak, pokrewieństwo gatunków)
- epidemiologicznym (rozprzestrzenienie przywr o znaczeniu medycznym lub weterynaryjnym)
Środowiskowe uwarunkowania inwazji przywr digenicznych u mięczaków
Różnorodność cerkarii przywr digenicznych u mięczaków
Jednym z kluczowych momentów w badaniach nad rozprzestrzenieniem przywr digenicznych w populacjach mięczaków było opracowanie przez Lühe (1909) systemu morfologicznej klasyfikacji cerkarii. Uwzględniając takie cechy jak liczba i ułożenie przyssawek, obecność ?płetwy? na ciele i położenie otworu gębowego autor wyróżnił pięć dużych grup morfologicznych tych stadiów, co znacznie ułatwiło opisywanie gatunków i stanowiło podstawę do rozpoczęcia faunistycznych badań Digenea w populacjach mięczaków. Prowadzone przez nas prace dotyczące bogactwa gatunkowego i różnorodności przywr digeniczncyh u mięczaków wpisują się w nurt badań mający na celu uzupełnienie obrazu krajowej parazytofauny zwierząt bezkręgowych.
Przynależność systematyczną pasożytów oceniamy na postawie charakterystyki morfologiczno-anatomicznej uzyskanych z mięczaka cerkarii biorąc pod uwagę takie cechy jak ogólny pokrój ciała, liczbę i położenie przyssawek, uzbrojenie ciała i ogona, obecność struktur czuciowych i plamek ocznych, budowę układu pokarmowego, wydalniczego itd. Nieodzownym narzędziem do tego typu prac jest mikroskop świetlny Primostar Carl Zeiss z kontrastem fazowym i oprogramowaniem umożliwiającym wykonanie zdjęć i pomiarów biometrycznych znalezionych pasożytów. W ostatnich latach nasze badania koncentrowały się na parazytofaunie słodkowodnych ślimakach pochodzących z wybranych jezior Pojezierza Brodnickiego. Prowadzone prace zaowocowały rozpoznaniem ponad 50 gatunków przywr digenicznych, których szczegółową charakterystykę opracowano w “Atlasie stadiów larwalnych Digenea” – załączniku rozprawy doktorskiej A. Cichy (2013).
Wpływ czynników środowiskowych na dynamikę zarażenia mięczaków przywrami
Ważnym aspektem naszych badań jest ocena ekstensywności i sezonowej dynamiki zarażenia mięczaków. Zebrane dane dotyczące miesięcznych frekwencji przywr u mięczaków pozwalają ocenić jak zarażenie zmienia się w czasie oraz czy określone gatunki Digenea charakteryzują się podobnym algorytmem występowania w populacjach mięczaków.
Istotne znaczenie w ocenie sezonowych zmian zarażenia mięczaków ma analiza czynników środowiskowych w miejscu poboru prób malakologicznych.
Prowadzone przez nas obserwacje terenowe obejmują między innymi ocenę składu gatunkowego potencjalnych żywicieli ostatecznych Digenea, ocenę charakteru dna i stopnia zarośnięcia jeziora makrofitami. W terenie przeprowadzamy także pomiary wybranych parametrów fizyko-chemicznych wody. Wymienione czynniki mogą istotnie wpływać na rozmieszczenie żywicielskich mięczaków i występujących w nich przywr w środowisku. Liczni autorzy podkreślają, że w małych i silnie zarośniętych jeziorach stopień zarażenia mięczaków przywrami jest zwykle większy niż w jeziorach dużych, o słabo rowiniętej roślinności makrofitowej. W zbiornikach małych wystęuje efekt “zagęszczenia propagul” w efekcie czego prawdopodobieństwo kontaktu między miracydiami a żywicielskimi ślimakami jest większe.
Badania z zakresu parazytologii weterynaryjnej i medycznej
Badając skład gatunkowy i dynamikę zarażenia mięczaków przywrami oceniamy również ryzyko wystąpienia na monitorowanym terenie chorób pasożytniczych człowieka i zwierząt hodowlanych. W naszych warunkach klimatycznych na szczególną uwagę zasługują tzw. ptasie schistosomy – przywry z rodzaju Trichobilharzia spp. będące etiologicznym czynnikiem “świądu pływaków”. Żywicielami pośrednimi Trichobilharzia spp. są ślimaki z rodziny Lymnaeidae, z kolei typowymi żywicielami ostatecznymi są kaczki. Omyłkowe wniknięcie uwalnianych ze ślimaka cerkarii przez skórę kąpiących się w jeziorach ludzi (niespecyficzny żywiciel ostateczny) skutkuje pojawieniem się uporczywie swędzącej wysypki.
Niebezpiecznym gatunkiem przywry o znaczeniu weterynaryjnym jest Fasciola hepatica wywołująca chorobę motyliczą u bydła i owiec. Nieleczona parazytoza prowadzi do spadku mleczności, wychudzenia zwierząt, a w przypadku owiec również do pogorszenia jakości wełny. W Polsce fascioloza była poważnym problemem weterynaryjnym i gospodarczym w latach 50. ubiegłego stulecia, jednak obecnie obserwuje się ponowny wzrost zachorowań zwierząt gospodarskch w niektórych regionach. Stwierdzenie czy na danym terenie utrzymuje się choroba motylicza opiera się na koproskopowym badaniu żywicieli ostatecznych przeprowadzanym przez weterynarzy oraz na parazytologicznej ocenie pastwisk, na których żerują błotniarki moczarowe (Galba truncatula) – główny na terenie Polski żywiciel pośredni F. hepatica.
Oprócz badań dotyczących alergizującego działania larw ptasich schistosom czy przypadków fascjolozy, prowadzimy również prace nad występowaniem innych parazytoz zwierząt hodowlanych i łownych: anisakiozy, syngamozy, alariozy, argazozy czy dermanyzozy, zarażenia psów i kotów pasożytniczymi helmintami, ale także rozprzestrzenienia w środowisku potencjalnie patogennych dla ludzi i zwierząt termofilnych protistów należących do tzw. FLA (free living amoebae). Projekt NCN ?Występowanie patogennych dla ludzi ameb typu limax i bakterii z rodzaju Legionella pneumophila w podgrzanych wodach oraz implikacje dotyczące ryzyka ich jednoczesnej inwazji? był realizowany we współpracy z pracownikami Zakładu Mikrobiologii Środowiskowej i Biotechnologii UMK.
Ekofizjologia interakcji przywry – mięczaki
Hematologia ślimaków
Badania z zakresu hematologii ślimaków dotyczą między innymi morfotycznego składu hemolimfy Pulmonata różniących się środowiskiem życia. W oparciu o kryteria ultrastrukturalne i behawioralne zaproponowaliśmy klasyfikację hemocytów występujących w hemolimfie Lymnaea stagnalis i Helix pomatia. Wśród wyróżnionych typów hemocytów znalazły się komórki hialinowe oraz młodociane i dojrzałe granulocyty. Te ostatnie wykazują wysoką aktywność fagocytarną np. w stosunku do komórek drożdży podanych w iniekcji. Stwierdzono znaczne różnice w zagęszczeniu morfotycznych elementów w płynie ustrojowym aktywnych i zimujących osobników H.pomatia, które wynikały nie tyle z różnic w uwodnieniu ciała zimujących zwierząt ile z różnej aktywności transportowej hemocytów, związanej z dekalcyfikacją muszli i wieczka tuż przed zakończeniem zimowania. Z kolei badanie morfotycznego składu hemolimfy słodkowodnych ślimaków pozwoliło wykazać leukocytozę u osobników zarażonych larwami przywr w porównaniu do osobników wolnych od pasożytów. Zmiany zagęszczenia hemocytów w hemolimfie korelowały ze stopniem eksploatacji żywicieli przez pasożyty. Sporocystorodne gatunki przywr w mniejszym stopniu odkształcały wskaźniki morfotyczne hemolimfy żywiciela w porównaniu do gatunków rediorodnych. W najbliższym czasie planujemy rozszerzenie badań hematologicznych na gatunki skrzelodyszne.
Testowanie hipotezy gigantyzmu muszlowego i hiperkalcyfikacji muszli
Wśród następstw inwazji przywr digenicznych u żywicielskich ślimaków wymienia się między innymi zwiększenie rozmiarów ciała zarażonych osobników wynikające z przyspieszonego wzrostu somatycznego spowodowanego zahamowaniem ich rozrodu. Ocenę gigantyzmu muszlowego prowadzi się zwykle w oparciu o porównywanie liniowych mierzalnych parametrów jak: wysokość, szerokość, wysokość skrętki, średnica itp., jednak wiele z opublikowanych danych nie potwierdza wpływu pasożytów na zwiększenie wymienionych wymiarów. Zaproponowaliśmy zastosowanie wewnętrznej objętości muszli do oceny gigantyzmu u Lymnaea stagnalis wywołanego obecnością pasożytów. Stwierdziliśmy, że ten parametr w większym stopniu oddaje istotę przyspieszenia somatycznego wzrostu zarażonych żywicieli niż pomiary liniowe. Te ostatnie okazały się bardzo przydatne w ocenie odkształcenia muszli ślimaków spowodowanego rozwojem partenit przywr. Podobnie jak w przypadku zmian w obrazie hemolimfy odkształcenie wzorca rozwoju muszli korelowało z intensywnością eksploatacji żywiciela przez pasożyty. Zaplanowano kontynuowanie badań tym razem na osobnikach Planorbarius corneus oraz Viviparus contectus.
Postulowana przez wielu badaczy hiperkalcyfikacja muszli u zarażonych osobników została przez nas negatywnie zweryfikowana w przypadku osobników L. stagnalis. Akceptujemy pogląd, że obecność partenit przywr hamuje lub wyłącza aktywność rozrodczą ślimaków powodując w konsekwencji odkładanie nadmiaru wapnia w konchach, co może stanowić podstawę hipotezy hiperkalcyfikacji. Jednak przeprowadzone przez nas badania na ślimakach żyjących w zbiornikach z twardą wodą nie potwierdziły wysuwanej sugestii. Wprawdzie w środowisku o obniżonej zawartości wapnia w wodzie zarażone przywrami ślimaki miały muszle z większą zawartością tego pierwiastka w porównaniu do nie zarażonych, ale zjawisko to było związane raczej z hipokalcyfikacją muszli osobników wolnych od pasożytów. Intensywny rozród nie zarażonych osobników jest procesem silnie wapniochłonnym, a niedobory pierwiastka w środowisku powodowały, że mniejsze jego ilości trafiały do muszli w porównaniu z osobnikami, które pasożyt kastrował. W planowanych w najbliższym czasie badaniach użyte zostaną osobniki P. corneus i V. contectus.
Termobehawior ślimaków
Po analizie algorytmu patentnych inwazji Digenea u Lymnaea stagnalis pochodzących z ponad dwudziestu lokalizacji stwierdziliśmy powtarzalną sezonową dynamikę transmisji inwazyjnych cerkarii ze ślimaków do środowiska zewnętrznego. W celu zbadania przyczyn tej powtarzalności przeprowadzono badania eksperymentalne nad termicznym behawiorem żywicieli. Czynnik termiczny w interakcjach między ślimakami i rozwijającymi się w nich larwami przywr digenicznych odgrywa ważną rolę w utrzymaniu stabilności układu żywiciel-pasożyt.
Prowadzone eksperymenty termobehawioralne pozwoliły wykazać zdolność generowania objawów anapireksji behawioralnej nie tylko u L. stagnalis zarażonych przez różne gatunki pasożytów w fazie patencji, ale również u przedstawiciela zatoczkowatych Planorbarius corneus. Beneficjentami niezaburzonej reakcji obronnej żywicieli są zarówno pasożyty jak i gospodarze. Wraz z zespołem badaczy z Uniwersytetu Warmińsko-Mazurskiego prowadzone są badania nad zawartością białek i sacharydów oraz aktywnością katalityczną enzymów (disacharydazy oraz dysmutazy nadtlenkowej) w hemolimfie zarażonych larwami przywr żywicielskich ślimaków poddanych działaniu czynnika temperaturowego. Wyniki badań biochemicznych wskazują na biochemiczne podłoże obserwowanych reakcji termobehawioralnych.
Równolegle z badaniami nad mechanizmem anapireksji behawioralnej u zarażonych przywrami ślimaków prowadzone są badania nad indukowaniem gorączki behawioralnej u osobników wolnych od inwazji pasożytniczej. Obiecujące wyniki prac z wykorzystaniem bakteryjnego lipopolisacharydu (LPS), wyizolowanego z drożdży zymosanu czy wirusowego kwasu poliryboinozyno-polirybocytydylowego (poli(I:C)) wskazują, że ślimaki z gatunku Planorbarius corneus zdolne są do behawioralnych reakcji gorączkowych. Celem prowadzonych prac jest wykorzystanie ślimaków jako modelowych zwierząt w badaniach nad mechanizmami procesu gorączkowego u bezkręgowców. Planowane aktualnie badania z zespołem biochemików nad występowaniem cyklooksygenazy 1 (COX-1) u P. corneus stanowią istotny element tych poszukiwań. Ponadto zaplanowano prace nad udziałem prostaglandyn w mechanizmie obserwowanych termicznych preferencji P. corneus.