Ciemna strona tolerancji endotoksynowej

Grant NCN PRELUDIUM BIS nr 2020/39/O/NZ5/00915 (2021-2025)
Ciemna strona tolerancji endotoksynowej: zwiększona podatność na raka
Kierownik: dr hab. Sylwia Wrotek Prof. UMK

Model tolerancji endotoksynowej makrofagów in vitro

W celu opracowania modelu tolerancji endotoksynowej (ET), makrofagi stymulowano 2 kolejnymi dawkami lipopolisacharydów (LPS). Następnie oceniono ekspresję cytokin prozapalnych zarówno na poziomie genów, jak i białek. Dane z obu analiz dały podobny wniosek, tj. stolerowane makrofagi wykazywały znaczny spadek poziomu cytokin prozapalnych, TNFα i IL-6. Jest to wskaźnik tolerancji (ET), ponieważ w przypadku jednokrotnej stymulacji makrofagów LPS obserwuje się odwrotny efekt.

Analiza fenotypu makrofagów 

Według literatury zjawisko ET wpływa również na fenotyp makrofagów. Dlatego, aby go określić, przeprowadzono analizę  markerów zarówno dla fenotypu M1, jak i M2 przy pomocy cytometrii przepływowej.

Przygotowanie medium kondycjonowanego

Jednym z głównych czynników odpowiedzialnych za progresję nowotworu jest wpływ mikrośrodowiska guza na komórki nowotworowe. Aby ocenić to w warunkach in vitro, otrzymano medium kondycjonowane ze stolerowanych makrofagów. Prowadzenie hodowli komórek nowotworowych w medium kondycjonowanym naśladuje mikrośrodowisko guza.

Test na przeżywalność komórek

Kolejnym krokiem była ocena wpływu stolerowanych makrofagów na przeżywalność komórek nowotworowych. Do tej analizy komórki rakowe traktowano różnymi stężeniami medium kondycjonowanego przez 24 i 48 godzin. Na koniec każdego punktu czasowego komórki inkubowano z MTT przez 3 godziny, a następnie po rozpuszczenie kryształów formazanu w DMSO, odczytano wartość absorbancji. Uzyskane dane wykazały, że medium kondycjonowane ze stolerowanych makrofagów może sprzyjać przeżywalności komórek nowotworowych.

Test migracji komórek

Ważnym aspektem sprzyjającym progresji nowotworu jest zdolność komórek nowotworowych do migracji do różnych części ciała. Dlatego przeprowadzono test zarysowania (scratch assay), aby zrozumieć, czy ET może wpływać na migrację komórek nowotworowych. W tym teście komórki wysiano i utrzymywano w normalnych warunkach aż do utworzenia pożądanej monowarstwy. Na powierzchni tej monowarstwy wykonano rysę i komórki utrzymywano w różnych stężeniach medium kondycjonowanego przez 20 godzin. Aby określić procent zamknięcia rany, wykonano zdjęcia zadrapań w 0h i 20h i przeanalizowano przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu. Ostatecznie analiza danych wykazała, że komórki utrzymywane w kondycjonowanej pożywce pochodzącej od makrofagów ET wykazywały zwiększoną zdolność migracji przez obszar rany, w porównaniu z kontrolą.

Wpływ ET na produkcję cytokin prozapalnych w środowisku kokultury makrofagów i komórek nowotworowych

W literaturze opisano, że makrofagi naciekające guz mają profil cytokin przeciwzapalnych zamiast prozapalnych. W ten sposób zapewniając odpowiednie środowisko do wzrostu guza. Dlatego, aby zbadać ten przesłuch między makrofagami a komórkami nowotworowymi, oceniliśmy ekspresję białka TNFα i IL-6 we wspólnej hodowli makrofagów normalnych i ET z komórkami nowotworowymi. Ekspresja białka IL-6 okazała się znacznie niższa we wspólnej hodowli makrofagów ET z komórkami nowotworowymi. Jednak TNFα wykazywał wyższą ekspresję w przypadku wspólnej hodowli makrofagów ET z komórkami nowotworowymi, w porównaniu do wspólnej hodowli nietraktowanych makrofagów i komórek rakowych.

Wpływ kondycjonowanej pożywki na sferoidy rakowe

Biorąc pod uwagę wcześniejsze dane dotyczące proliferacji komórek nowotworowych i dalszą ocenę wpływu kondycjonowanej pożywki, opracowano trójwymiarowy sferoidalny model komórek nowotworowych. Sferoidy powstały metodą wiszącej kropli. Hodowano je w różnych stężeniach kondycjonowanej pożywki przez 48 godzin. Następnie wykonano zdjęcia i przeanalizowano powierzchnię sferoidy. Analizy danych wskazywały na wpływ ET na sferoidy rakowe, ponieważ wielkość sferoid hodowanych w kondycjonowanej pożywce makrofagów ET była większa w porównaniu z sferoidami hodowanymi w normalnych warunkach. Wskazuje to zatem, że makrofagi ET rzeczywiście promują przeżywalność i wzrost komórek nowotworowych.